Khái niệm về ELISA và cơ chế hoạt động Dạo này tớ đang học miễn dịch học đại cương, lên bài sẵn ôn thi luôn. Hình 1. Bộ kit ELISA. (Medlatec) 1. Khái niệm ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme được sử dụng phổ biến để phát hiện và định lượng các phân tử như kháng nguyên, kháng thể, protein và hormone. Kỹ thuật này dựa trên phản ứng kháng nguyên-kháng thể đặc hiệu, kết hợp với một enzyme làm tín hiệu đánh dấu, nhằm khuếch đại tín hiệu và cho phép đo lường bằng thiết bị quang học. 2. Cơ chế hoạt động Cơ chế cơ bản của ELISA dựa trên nguyên tắc rằng kháng nguyên hoặc kháng thể sẽ được gắn cố định trên bề mặt rắn, thường là đáy giếng nhựa polystyrene của đĩa 96 giếng. Sau đó, mẫu chứa phân tử mục tiêu được thêm vào để thực hiện giai đoạn bắt cặp đặc hiệu. Tiếp theo, một kháng thể thứ hai liên hợp với enzyme sẽ được thêm vào, tạo thành một phức hợp. Enzyme liên kết này có khả năng xúc tác phản ứng biến đổi cơ chất (substrate) thành sản phẩm màu, có thể đo được bằng quang phổ ở bước sóng xác định. Phản ứng sinh màu chỉ xảy ra nếu có sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên - kháng thể được đánh dấu enzyme, do đó mức độ màu sắc tạo ra tỷ lệ thuận với lượng phân tử mục tiêu trong mẫu. Quy trình thường bao gồm các bước chính: Cố định phân tử lên bề mặt, chặn các vị trí không đặc hiệu, thêm mẫu, thêm kháng thể đánh dấu enzyme, thêm cơ chất, đọc tín hiệu và phân tích kết quả. 3. Phân loại Trong miễn dịch học, ELISA được phân thành bốn dạng chính dựa trên cách tổ chức phản ứng và phương thức bắt giữ kháng nguyên hoặc kháng thể. Hình 2. Hình này mô tả cái cơ chế ở dưới. (Xetnghiem.com.vn) (1) (Hình đầu tiên) Loại thứ nhất là ELISA trực tiếp. Trong phương pháp này, kháng nguyên được gắn trực tiếp lên bề mặt, sau đó được phát hiện bằng một kháng thể đã liên hợp sẵn với enzyme. ELISA trực tiếp có ưu điểm là quy trình đơn giản, nhanh gọn vì chỉ sử dụng một loại kháng thể, tuy nhiên nhược điểm là độ nhạy thấp và ít linh hoạt hơn do yêu cầu kháng thể phải được đánh dấu enzyme. (2) (Hình thứ hai á) Loại thứ hai là ELISA gián tiếp. Ở phương pháp này, kháng nguyên được cố định trước, sau đó thêm một kháng thể sơ cấp (không gắn enzyme) để bắt cặp, tiếp theo là một kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme để nhận diện kháng thể sơ cấp. ELISA gián tiếp cho độ nhạy cao hơn vì mỗi kháng thể sơ cấp có thể gắn nhiều kháng thể thứ cấp, khuếch đại tín hiệu, đồng thời linh hoạt hơn trong việc sử dụng nhiều hệ thống phát hiện khác nhau. (3) (Hình thứ ba) Loại thứ ba là ELISA sandwich. Phương pháp này yêu cầu hai kháng thể đặc hiệu cho hai epitope khác nhau của cùng một kháng nguyên. Đầu tiên, một kháng thể bắt giữ (capture antibody) được cố định trên bề mặt, sau đó mẫu chứa kháng nguyên được thêm vào để liên kết. Tiếp theo, kháng thể phát hiện (detection antibody) gắn với enzyme sẽ được thêm vào, tạo thành một "sandwich" bao gồm kháng thể - kháng nguyên - kháng thể. ELISA sandwich đặc biệt phù hợp cho phân tử có nhiều epitope và cho phép phát hiện các phân tử trong môi trường mẫu phức tạp với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. (4) (Hình cuối cùng) Loại thứ tư là ELISA cạnh tranh (competitive ELISA). Trong phương pháp này, sự hiện diện của kháng nguyên trong mẫu sẽ cạnh tranh với một lượng kháng nguyên chuẩn đã được gắn cố định trên bề mặt để liên kết với kháng thể. Số lượng kháng thể liên kết với bề mặt sẽ tỷ lệ nghịch với nồng độ kháng nguyên trong mẫu. Sau đó, một kháng thể thứ cấp liên hợp enzyme được thêm vào để tạo tín hiệu. ELISA cạnh tranh thường được sử dụng khi kháng nguyên là phân tử nhỏ hoặc có số lượng epitope hạn chế, không phù hợp cho ELISA sandwich. Mỗi loại ELISA có ưu nhược điểm riêng và được lựa chọn dựa trên mục tiêu xét nghiệm, đặc tính của mẫu, cũng như tính chất của phân tử cần phát hiện. Ví dụ như thầy tui bảo là ELISA ức chế thì nó sẽ không đặc hiệu -> dùng cho các bệnh chỉ xuất hiện ở vài loài, như bệnh giả dại ở heo nè. Nói chung là mỗi cái sẽ được dùng tùy theo mục đích và túi tiền phòng lab. 4. Ứng dụng của ELISA ELISA có vai trò vô cùng quan trọng trong nhiều lĩnh vực khoa học đời sống, y học và công nghiệp nhờ khả năng phát hiện nhanh chóng, đặc hiệu và nhạy các phân tử sinh học. Trong y học chẩn đoán, ELISA được ứng dụng phổ biến để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm, hỗ trợ chẩn đoán nhiều bệnh truyền nhiễm như HIV, viêm gan B, viêm gan C, sốt xuất huyết và cúm. Ngoài ra, ELISA còn giúp định lượng các chỉ dấu ung thư, hormone (như insulin, hCG trong xét nghiệm thai kỳ), cũng như đánh giá các bệnh tự miễn thông qua việc phát hiện tự kháng thể. Trong nghiên cứu sinh học phân tử và miễn dịch học, ELISA được dùng để khảo sát quá trình sản xuất kháng thể, nghiên cứu đáp ứng miễn dịch, đo nồng độ cytokine, chemokine và các yếu tố tăng trưởng trong các mô hình thí nghiệm. Đây là công cụ cơ bản để đánh giá hiệu quả của vaccine, kiểm tra sự hiện diện của kháng thể trung hòa trong các nghiên cứu về miễn dịch bảo vệ. Trong lĩnh vực thực phẩm và an toàn sinh học, ELISA được áp dụng để phát hiện các tác nhân gây dị ứng (như gluten, đậu nành, sữa), các chất gây ô nhiễm sinh học (như vi khuẩn Salmonella, E. Coli) và dư lượng kháng sinh trong thực phẩm. Việc sử dụng ELISA giúp đảm bảo sản phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn cho tiêu dùng. Trong công nghiệp dược phẩm, ELISA là một công cụ không thể thiếu trong kiểm soát chất lượng sinh phẩm, từ theo dõi quá trình sản xuất protein tái tổ hợp, vaccine đến kiểm tra mức độ nhiễm tạp như endotoxin hoặc virus trong sản phẩm sinh học. Ngoài ra, ELISA còn được ứng dụng trong thú y để chẩn đoán bệnh trên động vật, trong nghiên cứu môi trường để phát hiện độc tố hoặc chất ô nhiễm sinh học trong đất và nước. Với những ưu điểm như độ nhạy cao, khả năng xử lý số lượng mẫu lớn và quy trình tương đối đơn giản, ELISA đã trở thành một trong những phương pháp nền tảng trong hệ thống các kỹ thuật sinh học hiện đại. 5. Chi phí thực hiện ELISA Hiện giờ, ELISA kit khá là phổ biến. Như tui học thực hành sẽ dùng kit á. Nhưng mà nó khá đắt (nhưng ít đắt hơn vài phương pháp khác, mà nó nhanh hơn nữa). Chi phí của một xét nghiệm ELISA có thể dao động rất rộng tùy thuộc vào nhiều yếu tố như loại ELISA sử dụng, quy mô thí nghiệm, thiết bị hỗ trợ, chi phí nhân công và mục tiêu ứng dụng (lâm sàng, nghiên cứu hay công nghiệp). Đối với quy mô nghiên cứu, chi phí thường tập trung chủ yếu vào việc mua bộ kit ELISA thương mại hoặc tự thiết lập hệ thống xét nghiệm bằng cách mua rời từng thành phần. Một bộ kit ELISA tiêu chuẩn (ví dụ như kit đo cytokine, hormone) thường có giá từ 300 đến 700 USD cho 96 giếng, tương đương chi phí trung bình khoảng 3 đến 10 USD mỗi mẫu nếu tính đủ các mẫu tiêu chuẩn và mẫu thử. Các kit cao cấp hơn, yêu cầu độ nhạy rất cao hoặc phát hiện nhiều chỉ tiêu cùng lúc (multiplex ELISA), có thể có giá cao hơn nhiều, từ 1000 USD trở lên cho một bộ kit. Nếu tự thiết lập quy trình ELISA bằng cách mua riêng lẻ kháng thể, cơ chất, đĩa ELISA, dung dịch đệm và các hóa chất phụ trợ, chi phí ban đầu có thể thấp hơn tính trên số lượng lớn mẫu, nhưng đòi hỏi nhiều kỹ thuật tối ưu hóa và thời gian chuẩn hóa. Trong các trường hợp như vậy, chi phí nguyên liệu cho mỗi mẫu có thể hạ xuống dưới 2 USD, tuy nhiên cần đầu tư ban đầu cho thiết bị đọc quang phổ (ELISA reader) với giá từ khoảng 5000 đến 20.000 USD tùy loại máy đơn thuần hay đa chức năng. Đối với ứng dụng lâm sàng tại bệnh viện, chi phí xét nghiệm ELISA cho bệnh nhân thường cao hơn vì bao gồm cả chi phí nhân công, vận hành, kiểm định chất lượng và các yêu cầu pháp lý. Tại Việt Nam, xét nghiệm ELISA để phát hiện kháng thể HIV, viêm gan hoặc một số bệnh truyền nhiễm khác có giá dao động từ khoảng 150.000 đến 600.000 VNĐ mỗi xét nghiệm, tùy từng loại bệnh và cơ sở thực hiện. Nhìn chung, chi phí của ELISA được đánh giá là hợp lý so với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và khả năng kiểm tra số lượng mẫu lớn cùng lúc. Tuy nhiên, nếu yêu cầu phân tích số lượng mẫu cực lớn hoặc phát hiện nhiều chỉ tiêu cùng lúc, các phương pháp thay thế như hệ thống tự động hóa cao hoặc công nghệ multiplex cũng đang dần được cân nhắc để tối ưu chi phí lâu dài. -> Phải xem xét kỹ rồi định hướng dùng ELISA không, và dùng loại ELISA nào. Cảm ơn các bạn đã ghé qua đọc bài, chúc các bạn mùa thi cử tốt nha.
